A. J. Cook começou sua carreira na frente das câmeras em um comercial da rede McDonald's lançado em 1997 e, pouco depois, estreou no cinema fazendo uma figuração no filme Laserhawk. No mesmo ano, a atriz estrearia na televisão com uma participação no telefilme In His Father's Shoes e num episódio do seriado Goosebumps.
Nos anos seguintes, Cook continuou a trabalhar na televisão em telefilmes como Blue Moon e um episódio da série PSI Factor: Chronicles of the Paranormal e, em 1999, tornaria-se mais conhecida no cinema ao participar da primeira produção dirigida por Sofia Coppola, The Virgin Suicides, como Mary Lisbon.
Na sequência da participação no filme de Coppola, Cook continuou sua carreira no filme lançado diretamente em vídeo Teen Sorcery e, em 2000 conseguiu um papel regular na série Higher Ground interpretando Shelby Merrick, jovem que havia fugido de casa depois de ser abusada sexualmente por seu padrasto durante anos e onde fez par romântico com o ator Hayden Christensen.
Depois do cancelamento da série no mesmo ano por parte da Fox Family, Cook participou de um episódio da série First Wave, como Lindsay Tilden. No mesmo ano, ela também voltaria a atuar em produções cinematográficas: Ripper como Molly Keller e Out Cold como Jenny. Em 2002, ela ganharia o papel de protagonista no longa-metragem de sucesso Final Destination 2, que dava sequência ao primeiro filme e contava com a participação de Ali Larter.
Em 2003, a atriz voltaria à televisão com um papel regular no seriado Tru Calling como a irmã mais velha da protagonista. Com o cancelamento do programa em 2004, Cook faria participações em outros seriados e em telefilmes e em 2005 ingressaria no elenco de Criminal Minds como Jennifer Jareau, mais conhecida como J.J. na trama. Mais recentemente, a atriz estrelou o filme Misconceptions no papel de Miranda Bliss.