Seguindo os confrontos ocorridos no fim da primeira temporada, Peter começará a segunda temporada procurando por Eddie Brock, mas um dos grandes arcos no roteiro dessa temporada será uma guerra de gangues.

Novos personagens serão introduzidos na série, incluindo o Magma (Molten Man), Kraven, o Caçador, Calypso, Cabeleira de Prata, Ricochete e Silver Sable, e os personagens da primeira temporada irão retornar, como Dr. Octopus, Duende Verde, Gata Negra, Camaleão, Shocker, Abutre, Homem-Areia, Rhino, Electro, Venom, Lápide e Cabeça-de-Martelo. Os comparsas do Camaleão também retornarão, como Mysterio e O Consertador.